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基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术的6-姜酚

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术的6-姜酚

时间:2022-08-25 18:48:11 作者:华体会官网在线登录 来源:华体会平台登录
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  原标题:基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术的6-姜酚在大鼠体内代谢产物的鉴定及代谢途径的分析

  摘要:目的采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Quadrupole-Orbitrap high resolution mass spectrometry,UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)技术对6-姜酚在大鼠血浆、尿液和粪便中的代谢产物进行鉴定分析。方法SD大鼠ig给药6-姜酚羧甲基纤维素钠混悬液后,收集其血浆、尿液、粪便以及胆汁样品。样品前处理后,采用Waters Acquity UPLC ® BEH C 18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱。在电喷雾电离源(ESI源)正、负离子模式下采集生物样品的质谱数据。结果对代谢产物的质谱数据进行结构鉴定分析,检测到大鼠体内6-姜酚相关代谢产物共21个,其中血浆样品中5个代谢产物,尿液样品中9个代谢物,粪便样品中12个代谢产物,胆汁样品中8个代谢产物。结论通过液质联用技术阐明了6-姜酚在大鼠体内的代谢产物及其代谢途径,为今后相关研究提供重要的理论依据,同时也为药物代谢鉴定研究提供一种综合研究方法。

  姜为姜科(Zingiberaceae)植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎。株高0.5~1.0 m,根茎肥厚,多分枝,有芳香及辛辣味。根茎供药用,鲜品或干品可作烹调配料或制成酱菜、糖姜。茎、叶、根茎均可提取芳香油,用于食品、饮料及化妆品香料中。其中药性表现为发散风寒、化痰止咳,又能温中止呕、解毒等,常常用于外感风寒及胃寒呕逆等症的治疗[1-2]。

  姜的化学成分繁杂,主要归属3大类:挥发油类(萜类化合物)、二苯基庚烷类(1,7-二取代苯基庚烷骨架)和姜辣素类。姜辣素是姜中辣味成分的总称,其中6-姜酚在姜的辣味成分中含量最高,也是姜的主要活性成分[2-5]。6-姜酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、强心、降压、调血脂、降血糖、抗凝等多种生物学活性。其中6-姜酚在抗肿瘤方面具有良好的应用前景[6],还具有保肝利胆、消炎、镇咳、防晕止吐、抑制中枢神经等多种功效,杀虫、抗病原微生物和杀菌防腐作用[7-9]。目前,对于6-姜酚的提取分离方法、分析测定方法和生物活性研究较为全面,而且药代动力学研究显示,6-姜酚在机体内快速吸收并迅速消除,且这一变化规律与给药途径及给药剂量没有显著的关联性[10],但对6-姜酚的体内代谢过程和代谢产物尚不明确[11-13],亟需进一步研究。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)建立了一种灵敏度高、准确性好的鉴定药物体内代谢产物的研究方法,对大鼠血浆、尿液和粪便中6-姜酚的主要代谢产物进行鉴定分析,为6-姜酚的进一步药用开发奠定基础。

  UHPLC-Q-Exactive液质联用仪:离子源采用HESI源(heated ESI),辅助气体积流量为10 μL/min,辅助气温度为300℃,离子传输管温度320℃;正离子模式:鞘气体积流量40 μL/min,喷雾电压3.50 kV;负离子模式:鞘气体积流量38 μL/min,喷雾电压2.80 kV。扫描方式采用正、负离子Full MS/dd-MS 2模式,其中包括1次一级全扫描(分辨率为70 000 FWHM)和1次数据依赖的二级扫描(分辨率为17 500 FWHM)2个事件,质荷比窗口宽度设置为2,碰撞能梯度为20、40、60 eV,扫描范围m / z 80~1200。

  实验前,将SD大鼠随机分为3组(采血组、集尿组、胆汁组),每组6只,再将各组分为空白组(3只)和6-姜酚给药组(3只),在动物房内适应性喂养1周,饲养环境温度控制在20℃。

  受试前1天,将大鼠置于代谢笼中,禁食不禁水12 h。给药组以10 mg/kg的剂量大鼠ig给予6-姜酚CMC-Na混悬液,空白组大鼠ig等体积0.5% CMC-Na溶液。分别于ig给药前和给药后5、10、15、30 min和1、2、4、6、10 h眼眶取血300 μL,置于1.5 mL肝素钠抗凝EP管中,轻摇3下,4℃、3000 r/min离心10 min,取上清液,−20℃保存,备用;收集0~24 h 2组大鼠的尿液,滤过,置于EP管中,−20℃保存,备用;收集0~24 h 2组大鼠的粪便,置于EP管中,−20℃保存,备用。胆汁组大鼠采用5 mg/kg ip乌拉坦(20%)进行麻醉,对大鼠实施胆管插管手术。给药组大鼠以10 mg/kg的剂量ig给予6-姜酚CMC-Na混悬液,收集0~24 h胆汁样品,−20℃保存,备用。若实验过程取血不足,则可在给药1 h后ig适量生理盐水[14-15]。

  精密称定6-姜酚对照品适量,置10 mL量瓶,甲醇定容,配制成0.1 mg/mL储备液。稀释100倍后,取200 μL置进样瓶,进样;甲醇、乙腈、水按1∶1∶1各取100 μL,涡旋混合30 s,作为空白溶剂,取200 μL置进样瓶,进样。

  取所有不同采血点血浆各100 μL均匀混合,进行甲醇沉淀(1∶3),涡旋3 min,4℃、13 000 r/min离心10 min。取上清,浓缩至干;用50%甲醇水80 μL复溶,涡旋30 s,超声10 s,4℃、13 000 r/min离心5 min,上清液置进样瓶,进样[16];取尿液200 μL和200 μL甲醇置EP管,涡旋2 min,4℃、13 000 r/min离心10 min,取上清液,浓缩至干;取50%甲醇水80 μL复溶,涡旋30s,超声10 s,4℃、13 000r/min,离心5 min,取上清液置进样瓶,进样;取胆汁样品100 μL,甲醇(1∶3)沉淀蛋白,涡旋3 min,4℃、13 000 r/min离心10 min。取上清,浓缩至干,用50%甲醇80 μL复溶,涡旋30 s,超声10 s,4℃、13 000 r/min离心5 min,上清液置进样瓶,进样;取粪便样品,晾干,研磨,精密称定0.15 g,加入1.5 mL的80%甲醇水,超声提取20 min,4℃、5000 r/min离心10min,取上清,经0.22微孔滤膜滤过,取200 μL置进样瓶,进样。

  对处理后的血浆、尿液、粪便样品进行质谱分析,扣除空白背景后,依据质谱提供的准分子离子和加荷离子等信息推测并得到一级质谱的精确相对分子质量,经Xcalibar 2.0软件拟合分子式,误差范围在1×10 −5并与数据库信息对比,对代谢物结构进行初步推测,再依据对照品的ESI-MS 2谱和相关参考文献[3,13,16],进一步推断代谢物的化学结构。

  在正离子模式下,实验结果中未提取到6-姜酚对照品(C 17 H 26 O 4)的离子流色谱图,仅能提取到C 17 H 24 O 3的离子流色谱图,其产生m/ z 277.179 32 [M+H] +的准分子离子峰(tR=17.87min)。推测6-姜酚对照品在未受到粒子冲撞前已经发生了结构变化,丢失了1分子H 2 O,见图1。M 0的tR=17.87min,m/ z 277.179 32,将M 0准确鉴定为6-姜酚原型丢失1分子H 2 O。在其ESI-MS 2谱中,m/ z 277经碰撞诱导裂解后产生一系列二级碎片离子m/ z 259、189、177、162、145等。其中,m/ z 277中性丢失1分子H 2 O形成的m/ z 259,继续丢失长链烷基(C 5 H 10)形成m/ z 189;m/ z 189脱掉1个甲基形成的m/ z 177,继续脱甲基形成m/ z 163;m/ z 145由m/ z 162中性丢失1分子H 2 O而形成。由此,可推测6-姜酚经碰撞诱导裂解易脱水,并且易产生脱烷基的碎片离子峰,尤其易产生丢失甲基的碎片离子峰。这可能与6-姜酚母核中存在烷基长链有关[16]。

  基于UHPLC-Q-Orbitrap技术分析给药后的大鼠血浆、尿液和粪便,通过对比给药前后的生物样品图谱,结合色谱保留时间、精确相对分子质量、多级碎片离子等信息的分析,共鉴定了原型在内的22个代谢产物,其中大鼠血浆中鉴定代谢产物5个、尿液中鉴定代谢产物9个、粪便中鉴定代谢产物12个、胆汁中鉴定代谢产物8个,具体代谢产物质谱信息见表1。

  3.2.1大鼠血浆中代谢产物的鉴定大鼠血浆鉴定代谢产物5个,分别为M 1~M 5。M 1的相对分子质量比6-姜酚母核少34,其准分子离子峰为m / z 261.147 98 [M+H] +(C 16 H 20 O 3)。其分子式较6-姜酚母核少1个C、1个O和6个H,对比M 0的裂解规律,推测其脱去了苯环上的甲氧基(CH 2 O),但实际相对分子质量又缺少4,推测同时又脱去长链上H形成2个双建。因此,M 1可鉴定为6-姜酚的去甲氧基和双脱饱和(脱H)代谢产物。

  在正离子模式下,检测到2个色谱峰M 2(C 17 H 24 O 3,t R=18.23 min)、M 3(C 17 H 24 O 3,t R=14.86 min)。两者的实验相对分子质量均与M 0相同,推测二者同样由6-姜酚母核中性丢失1分子H 2 O而得到,且都产生了m / z 259、189、177、163等碎片离子,得到的碎片离子与M 0裂解产生的碎片离子基本相同,进一步验证了上述推断。因此,可将两者鉴定为6-姜酚的脱水产物。

  M 4的准分子离子峰为m / z 281.246 86 [M+H] +(C 18 H 32 O 2),其分子式较6-姜酚少2个O、多1个C和6个H。在ESI-MS 2谱中,得到了6-姜酚对照品的m / z 295、249、177碎片离子,而M 4在二级裂解过程中产生的m / z 263较m / z 249多14,推测母核发生甲基化;产生的m / z 263较m / z 295少32,推测母核发生硝基还原;产生的m / z 179较m / z 177多2,推测母核发生还原(双建加H)。因此,推测M 4是由6-姜酚母核发生还原(双建加H)、硝基还原、甲基化得到的代谢产物。

  M 5的准分子离子峰为m / z 289.215 18 [M+H] +(C 19 H 28 O 2)。对比其与M 15、M 16的实验相对分子质量和二级谱图,发现M 5在发生乙酰化和硝基还原反应的同时又脱去1分子H 2 O。由此,推测M 5是由6-姜酚乙酰化、硝基还原和脱水而得到的代谢产物。

  3.2.2大鼠尿液中代谢产物的鉴定大鼠尿液鉴定代谢产物9个,分别为M 1、M 2、M 3和M 6~M 11。代谢产物M 6~M 11的鉴定结果如下。

  在正离子模式下,M 6的准分子离子峰为m / z 493.203 34 [M+Na] +(C 23 H 34 O 10)。其相对分子质量较6-姜酚多176,推测是6-姜酚葡萄糖醛酸结合反应产物。由其二级裂解产生的m/ z 317产物离子(丢失了1分子葡萄糖醛酸),可进一步确认上述推断[14]。M 7的准分子离子峰为m / z 463.192 84 [M+Na] +(C 22 H 32 O 9)。其相对分子质量较M 6少30,并且其二级裂解产生的碎片离子m / z 287,是由m / z 463脱去1分子葡萄糖醛酸产生的。因此,可将M 7鉴定为6-姜酚单去甲氧基和葡萄糖醛酸结合产物。

  M 8的准分子离子峰为m / z 259.168 61 [M+H] +,其分子式为C 17 H 22 O 2。其相对分子质量比M 0少18,推测其由6-姜酚母核中性丢失2分子H 2 O形成。因此,可将M 8鉴定为6-姜酚的双脱水产物。

  M 9的准分子离子峰为m / z 261.184 48 [M+H] +(C 17 H 24 O 2)。M 9比6-姜酚母核的相对分子质量同样少34,对比其分子式较6-姜酚母核少2个O和2个H,并且在其二级裂解过程中产生了m / z 229的碎片离子,推测该碎片离子为m / z 243丢失甲氧基上的甲基(-CH 2)形成,进而推测M 9未脱去苯环上的甲氧基,而是脱去2分子H 2 O,但由于其实际相对分子质量数并未减少36,推测是6-姜酚母核长链上的羰基还原后以羟基形式脱去。由此,推测M 9是由6-姜酚发生还原反应(还原羰基)、双脱水反应而得到的代谢产物。

  M 10的准分子离子峰为m / z 423.248 14 [M+H] +(C 22 H 34 N 2 O 6)。依据其分子式C 22 H 34 N 2 O 6,初步推测6-姜酚母核发生了谷氨酰胺结合,在其ESI-MS 2谱中产生的m / z 362由6-姜酚母核脱去基团CH 9 NO 2得到,从而进一步验证了M 10中含有谷氨酰胺结构。再对比M 10与6-姜酚母核的分子式,发现其结构还缺少1个O,推测6-姜酚母核还发生了单去羟基化反应。由此,推测M 10是6-姜酚的谷氨酰胺结合和单去羟基化产物。

  M 11的准分子离子峰为m/ z 495.218 72 [M+Na] +(C 23 H 36 O 10)。依据其分子式,初步推测6-姜酚母核发生了葡萄糖苷结合和氧化反应。在其二级裂解的过程中,M11产生了m/z319的碎片离子,其由m/z495脱去C6H8O6大基团而得到,从而进一步验证了上述推测,并且推测6-姜酚氧化部位在葡萄糖苷部分。由此,推测M11是6-姜酚的葡萄糖苷结合和氧化反应产物。

  3.2.3大鼠粪便中代谢产物的鉴定大鼠粪便鉴定代谢产物12个,分别为M 1、M 4、M 5、M 9、M 11和M 12~M 18。代谢产物M 12~M 18的鉴定结果如下。

  在正离子模式下,M 12的准分子离子峰为m / z 297.241 73 [M+H] +(C 18 H 32 O 3)。在其二级裂解过程中,得到m / z 279、261碎片离子,与M 4的碎片离子m / z 281、263对比推测出M 12在6-姜酚母核的结构上同样发生了硝基还原和甲基化反应,但未发生还原反应(双建加H)。根据实验相对分子质量计算,在进行上述反应后得实验相对分子质量仍较6-姜酚母核多18,推测M 12又发生了水合反应,在M 12的二级裂解过程中m / z 279由m / z 297脱去1分子H 2 O得到,进一步证明了上述推测。由此,推测M 12是6-姜酚的甲基化、硝基还原、水合作用的代谢产物。

  M 13的准分子离子峰为m / z 289.179 17 [M+H] +(C 18 H 24 O 3)。其分子式较6-姜酚母核多1个C,少1个O和2个H。推测6-姜酚在大鼠体内发生了甲基化反应和脱水反应,在M 13的ESI-MS 2谱中,m / z 289较6-姜酚甲基化产物的实验相对分子质量少20,再推测6-姜酚在大鼠体内发生甲基化和脱水反应,并且脱去2个H形成1个双键。由此,推测M 13为6-姜酚的甲基化、脱水、脱饱和产物。

  M 14的准分子离子峰为m / z 329.171 54 [M+Na] +(C 18 H 26 O 4)。M 14的实验相对分子质量较6-姜酚母核多12,分子式较6-姜酚多1个甲基,推测M 14是由6-姜酚母核甲基化和脱饱和(脱去2个H)而得到的产物。

  M 15的准分子离子峰为m / z 329.210 33 [M+Na] +(C 19 H 30 O 3)。其分子式较6姜酚母核多2个C、少1个O,并依据其一级谱图、二级谱图初步推测M 15是由6-姜酚母核发生乙酰化和硝基还原得到的代谢产物,在其ESI-MS 2谱中,m / z 285可能为M 15脱落乙酰基得到的离子碎片,进一步验证了上述推测。由此,推测M 15是6-姜酚乙酰化和硝基还原而得到的代谢产物。同理,M 16的准分子离子峰为m / z 331.225 77 [M+Na] +(C 19 H 32 O 3)。M 16的实验相对分子质量仅比M 15多2,并结合其分子式以及一级谱图和二级谱图推测M 16是由6-姜酚发生乙酰化、硝基还原和还原反应而得到代谢产物。M 17的准分子离子峰为m / z 411.249 66 [M+H] +(C 21 H 34 N 2 O 6)。依据其分子式C 21 H 34 N 2 O 6,初步推测6-姜酚母核发生了谷氨酰胺结合,在其ESI-MS 2谱中产生的m / z 352由6-姜酚母核脱去基团CH 9 NO 2得到,从而进一步验证了M 17中含有谷氨酰胺结构。再对比M 17与6-姜酚母核的分子式,发现还缺少1个C和1个O,推测6-姜酚母核还发生了去甲基和还原反应(还原羰基)。由此,推测M 17是6-姜酚发生谷氨酰胺结合、去甲基化反应和还原反应得来的代谢产物。

  M 18的准分子离子峰为m / z 356.260 99 [M+H] +(C 20 H 37 NO 2 S)。依据其分子式C 20 H 37 NO 2 S,初步推测6-姜酚母核发生了半胱氨酸结合,在其二级裂解过程中得到了m / z 121离子碎片,从而验证了上述推测;得到了m / z 339离子碎片,m / z 339由m / z 356脱去1分子NH 3得到的,进一步说明了半胱氨酸羧基端与6-姜酚结合,并且进一步对比M 18与6-姜酚的分子式发现,M 18较6-姜酚母核缺少3个O,推测其又进行了硝基还原和还原反应(还原羰基)。由此,推测M 18是6-姜酚在大鼠体内发生半胱氨酸结合、硝基还原和还原反应(羰基还原)的代谢产物。

  3.2.4大鼠胆汁中代谢产物的鉴定大鼠胆汁鉴定代谢产物8个,分别为M 3、M 6、M 8、M 11、M 14和M 19~M 21。代谢产物M 19~M 21的鉴定结果如下。

  在正离子模式下,M 19的准分子离子峰为m / z 299.127 44 [M+Na] +(C 16 H 20 O 4)。其分子式较6-姜酚母核少1个C,6个H,初步推测6-姜酚母核脱去了亚甲基基团(CH 2),但其分子式又缺少4个H,进一步推测6-姜酚母核又发生了2次脱饱和反应(脱H)。因此,可将M 19鉴定为6-姜酚母核发生去甲基化反应和双脱和反应(脱H)而得到的代谢产物。

  M 20的准分子离子峰为m / z 365.192 47 [M+Na] +(C 18 H 30 O 6)。其分子式较6-姜酚母核多1个C、2个O、4个H。对比其与6-姜酚母核的二级裂解碎片,推测M 20由6-姜酚母核脱去甲基基团(CH 2)并进行2次氧化反应而得到。M 21的准分子离子峰为m / z 365.192 47 [M+Na] +(C 19 H 30 O 5)。在M 21的ESI-MS 2谱中,得到了m / z 285碎片离子,推测由m / z 327脱去乙酰基基团而得到,初步推测6-姜酚母核发生了乙酰基结合反应。但M 21的分子式又较6-姜酚母核多2个H,因此可将M 21鉴定为6-姜酚的乙酰基结合反应和还原反应的代谢产物。

  从大鼠的血浆、尿液、粪便和胆汁鉴定了6-姜酚原型在内的22个代谢产物,其主要的体内代谢反应有脱水、去甲氧基、去甲基化、乙酰化、硝基还原、葡萄糖醛酸化以及它们的复合反应等。其中少数代谢产物发生了谷氨酰胺结合、半胱氨酸结合等结合反应。6-姜酚较容易较易发生去甲氧基、去甲基化、乙酰化和硝基还原等反应。其主要代谢途径见图2。

  本实验采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对6-姜酚在正常SD大鼠血浆、尿液、粪便和胆汁中的代谢产物进行鉴定分析。结果表明,6-姜酚在大鼠体内的主要代谢反应有脱水、去甲氧基、乙酰化、硝基还原、葡萄糖醛酸化、去羟基化以及相关的复合反应等。通过分析这些代谢产物的精确相对分子质量、质谱裂解规律以及特征碎片离子等,筛选鉴定了包括6-姜酚原型在内的22个代谢产物,探讨了6-姜酚的在大鼠体内的代谢途径和裂解规律,为进一步研究6-姜酚的代谢产物及作用机制提供参考。